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BB娱乐平台登录艾弗森FSHW 槲皮素类化合物对丙烯酰胺引起的肝脏毒性保

发布时间：2024-02-19 09:53:27 来源：BB贝博作者：贝博艾弗森体育网页版访问次数：

　　槲皮素化合物是一类具有抗氧化、抗炎和抗癌药理功能的天然多酚类化合物，广泛分布于普通食品中，以槲皮素为配糖体连接不同的糖苷。以往的研究表明，槲皮素可以抑制血小板聚集和细胞毒性并能发挥抗氧化活性、清除自由基并保护神经细胞免受氧化应激引起的细胞损伤。此外，槲皮素对肝脏和其他有害物质引起的肝损伤有保护作用。

　　丙烯酰胺(AA)是一种在油炸和烘烤的富含淀粉的食品中检测到的具有神经毒性、肝脏毒性、生殖毒性和潜在的致癌性的物质，它可能由Maillard反应形成，当加工温度高于120 ℃时，食物中的游离天冬氨酸和糖反应最终形成AA。近年来，越来越多关于AA的研究集中在线粒体功能障碍和氧化应激引起的肝脏毒性。肝脏是脊椎动物的一个器官，具有代谢功能，可以消化营养物质，合成蛋白质和解毒。因此，当有害物质进入后，会进入肝脏进行分解代谢。许多研究发现，AA作为食物中的有害物质，进入肝脏后，可能会对肝脏的结构和功能造成损害。因此，找到有效的方法来减少AA的毒性是非常重要的。近年来，大量研究表明，一些植物来源的多酚和黄酮类化合物可以有效地抑制AA的毒性。

　　在这项研究中，槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷和金丝桃苷被用来进行研究。三种带有糖苷的槲皮素类化合物分别在C3处羟基连接鼠李糖苷、葡萄糖苷以及半乳糖苷。由于这三种槲皮素类化合物与槲皮素相比，连接不同的糖苷，因此在化学性质上可能存在差异。然而，到目前为止还没有数据证明具有不同结构的黄酮类化合物如何影响AA的肝脏毒性。

　　西北农林科技大学李鳞子博士和雷雪莹硕士，陈琳教授和冯宪超教授等研究了槲皮素及与其结构相似的的槲皮素类化合物对于AA引起的的肝脏毒性的保护机制。本研究以昆明小鼠和人肝癌细胞(HepG2)为体内和体外研究模型，评估AA影响的三个信号通路相关过程（氧化应激、自噬和细胞凋亡）。同时评估了槲皮素类化合物对AA引起的细胞信号通路变化的影响，并研究了不同结构的槲皮素化合物在AA诱导的肝脏毒性中的保护机制和结构-活性关系。该研究为解决AA引起的肝脏毒性提供了途径，为寻找更有效的槲皮素化合物降低AA的危害提供了理论支持。

　　小鼠肝脏的组织病理学切片结果显示AA处理组小鼠的肝脏出现了明显的病理变化，如严重的静脉充血、炎症细胞浸润和肝细胞索紊乱，说明AA对小鼠的肝脏有损害作用。而槲皮素类化合物可以治疗AA对小鼠造成的肝损伤，静脉充血得到改善，炎症细胞浸润得到缓解。

　　AA诱导的肝损伤可能与氧化应激相关。在体内试验中，如图2a所示，AA处理使得小鼠肝脏中氧化应激相关蛋白HO-1和NQO1蛋白表达明显增加，口服槲皮素可逆转这一变化。然而，槲皮素及其苷衍生物的结构差异并没有引起HO-1和NQO1蛋白表达的显著差异。此外，图2b、c显示AA处理使得生物系统中抗氧化酶SOD含量降低、脂质过氧化物MDA的含量增加，说明引起了肝脏的氧化应激，而槲皮素类化合物对其均有缓解作用，且槲皮素的调节作用最显著。HepG2细胞模型中也验证了AA激活细胞的氧化应激，使得相关蛋白的表达量增加(图2d)和ROS水平升高(图2e)，而槲皮素类化合物对AA引起的氧化应激有保护作用。

　　槲皮素类化合物通过激活自噬通路对AA引起的肝损伤起保护作用。体内研究发现，WB结果(图3a)显示AA处理组mTOR及AKT磷酸化水平显著减弱，说明自噬上游被激活，自噬水平明显增强，而槲皮素类化合物能通过增强mTOR及AKT磷酸化，减弱AA引起的自噬发生。AA能使小鼠肝脏beclin-1和Atg7蛋白表达均明显增强，进一步证明了AA引起了小鼠肝脏自噬的发生，并且槲皮素类化合物能在不同程度减弱这种自噬的发生。因此，槲皮素类化合物能够通过抑制自噬的激活，从而减弱自噬体形成相关蛋白的表达来抑制AA引起的自噬，槲皮素的抑制效果最显著。此外，利用免疫荧光对LC3进行标记，如图3b所示LC3II在AA处理的小鼠肝中的定位明显增强。并且槲皮素类化合物预处理组的小鼠肝脏中，LC3的激活明显减弱，进一步说明了槲皮素类化合物对AA引起的肝损伤的改善效果体现在自噬通路的改变上。

　　利用HepG2细胞模型进行体外试验也验证了AA引起了细胞自噬且槲皮素化合物对自噬的减弱效果。首先，对AA和槲皮素类化合物的处理浓度进行筛选，最终选择20μmol/L槲皮素类化合物对细胞进行预处理，再用4mMAA处理24h，并以此为细胞模型进行后续实验。如图4a所示，WB结果显示20μmol/L的四种槲皮素类化合物预处理细胞，均能使AA引起的LC3的转化减弱，且槲皮素的减弱作用最强，LC3的免疫荧光图也显示AA处理的细胞绿色荧光强度明显增高，而槲皮素类化合物预处理，能明显阻止LC3的激活，以上结果与体内试验的结果一致。此外，对自噬上游的关键信号因子mTOR进行检测，发现AA能使mTOR的磷酸化减弱，增强细胞自噬，而四种槲皮素类化合物均能改善mTOR磷酸化水平，阻止AA引起的自噬。LC3的激活使其附着在自噬体上，成为自噬体的结构蛋白。透射电镜结果(图4c)显示对照组细胞内部结构，可以观察到细胞核(图中Nu表示)结构完整，且核周围分布着线粒体、内质网、高尔基体等细胞器，未观察到大量自噬体，具有正常的细胞结构。AA处理后，透射电镜下发现细胞中存在双层膜的自噬体结构，如箭头所示自噬体中虽未见完整细胞器，但可能包裹有其他碎片，说明自噬在AA处理后被激活，还观察到细胞核略发生收缩，核质边沿化，可能存在凋亡小体形成早期阶段。当预处理槲皮素类化合物后，细胞核周围自噬体减少，细胞结构较为完整，进一步说明槲皮素类化合物预处理能改善AA引起的细胞自噬。

　　自噬和凋亡在机体内通常有着一定关联。正常情况下，自噬为机体吞噬消灭衰老损伤物质，使机体恢复平衡，减少凋亡的发生。但也有许多研究表明，自噬和凋亡具有协同作用，当外界刺激使自噬不足以维持平衡时，自噬有可能会促进凋亡的发生。如图5a所示，WB结果发现AA通过线粒体通路激活了caspase-9，从而诱导了下游凋亡通路的激活。促凋亡蛋白bax表达增加而抑凋亡蛋白bcl-2表达减弱，最终caspase-3被剪切，发生细胞凋亡，而槲皮素类化合物处理能明显改善caspase-3激活。在本试验中，虽然不同槲皮素类化合物对AA引起的caspase-9的激活具有不同抑制效果，但最终都抑制了caspase-3，其中的作用机制值得进一步探索。此外，AA也通过激活内质网应激通路介导细胞凋亡。AA处理使得BIP表达增加，引起IRE1磷酸化，激活内质网应激IRE1α-xbp1通路，激活caspase-12可对caspase-3进行剪切，促进调亡发生;此外AA还能引起PERK通路中CHOP蛋白表达来增强凋亡，而槲皮素类化合物预处理，会减弱内质网应激的激活，从而改善细胞凋亡，保护肝脏。

　　研究发现，细胞中ROS含量增加会导致线粒体膜电位(MMP)的下降，改变膜通透性，从而引起细胞凋亡。如图5b所示，AA处理细胞，能明显减少JC-1的聚集，细胞中JC-1单体显著增加，因此MMP下降，从而可能引起细胞凋亡的发生。而槲皮素类化合物能明显改善JC-1单体的增加，在这四种化合物中，槲皮素和金丝桃苷的减弱作用更加明显，可能对AA导致的细胞凋亡保护作用更强。此外，WB结果(图5c)显示，AA处理能明显上调caspase-3的剪切，使内质网应激通路相关蛋白CHOP、BIP、xbp1的表达显著上调，而槲皮素类化合物预处理均能明显改善凋亡相关蛋白的上调，进而抑制凋亡并发挥保护作用。流式细胞术检测细胞凋亡水平(图5d)进一步说明了四种槲皮素类化合物预处理均能减弱细胞早期凋亡及晚期凋亡数量。