BB娱乐平台登录艾弗森中药1区-郑州大学：综合药动学-代谢组学探究复方麻

　　脉络舒通丸（MLST）已显示出抗血栓闭塞性脉管炎（TAO）的药理活性。然而，MLST对TAO的活性成分和治疗机制仍有待进一步阐明。本研究旨在通过整合药代动力学（PK）和药物代谢组学（PM），探讨MLST的活性成分及其对抗TAO的协同机制。我们用月桂酸钠溶液建立TAO模型大鼠。首先，我们通过坏疽评分、血流速度和苏木精-伊红（H&E）染色评估MLST的疗效；通过非靶向代谢组学发现了月桂酸钠诱导的TAO大鼠的多种血浆和尿液代谢生物标志物，然后利用多变量和生物信息学方法分析了MLST处理后TAO改变代谢产物的变化。此外，我们使用MetaboAnalyst进行代谢途径分析；最后，通过相关分析建立了吸收的MLST化合物与TAO相关内源性代谢产物之间的动态联系。MLST通过改善TAO大鼠的炎性细胞浸润和血液供应，显著减轻坏疽症状。假手术（Sham）和TAO大鼠血浆中的17种差异代谢物和尿液中的24种差异代谢物的代谢谱存在显著差异。10种生物可利用的MLST化合物，如绿原酸和芍药苷，与谷氨酸代谢、组氨酸代谢、花生四烯酸代谢等相关的各种TAO差异代谢物呈正相关或负相关。本研究首次探索了MLST与生物系统之间的动态相互作用，为揭示MLST的活性成分及其对抗TAO的协同机制提供了独特的见解，这也为TAO治疗提供了新的靶点。

　　我们先前的结果表明，给予3.8、7.6或15.2 g/kg的MLST均显示出明显的治疗效果；然而，没有剂量依赖性效应，与其他药物相比，低剂量的MLST产生了最高的疗效。因此，我们选择3.78 g/kg MLST的剂量用于后续研究。在本研究中，我们研究了MLST对月桂酸钠注射诱导的大鼠TAO模型的影响。术后第二天给TAO大鼠施用MLST，并通过每天给药一次，持续2周（图2A）。注射月桂酸钠后，TAO组和MLST-14D组大鼠右下肢出现不同程度的缺血性坏死。根据血管炎模型评分标准，术后1周和2周，MLST-14D组的评分显著低于TAO组（图2B）。然后我们用激光散斑血流仪测定最后一次给药后每只大鼠的血流量。我们测量了缺血和对侧后肢的血流，然后计算了缺血与对侧正常动脉的血流比率（图2C）。MLST中的比率显著高于TAO中的比率，表明MLST恢复了缺血血流（图2D）。H&E染色显示，Sham组股动脉内膜光滑完整，细胞排列整齐。在TAO大鼠中，我们观察到明显的形态学变化，包括内皮细胞脱落、内皮不完整和炎性细胞浸润。然而，我们发现，MLST能够显著减少炎性细胞浸润和内皮细胞脱落（图2E）。

　　经验证，灵敏的LC-MS/MS方法能够同时定量大鼠血浆中的10种化合物浓度。如图S1所示，无分析物的基质对任何分析物都没有表现出任何明显的干扰峰。表S2显示了分析浓度范围内10种分析物的校准曲线和LLOQ。所有校准曲线。LLOQ范围为0.1 ng/ml至0.5 ng/ml。日内和日间准确度（RE）分别在−9.98%至14.33%和−7.36%至13.78%的范围内（表S3）。三种加标浓度的日间精密度（RSD）分别为1.04%至8.20%和2.17%至7.61%。在90.19%至109.57%的范围内，没有显著的基质效应（表S4）。经证实，测试组 E在90.43%至112.40%的范围内，RSD小于9.77%（表S5）。因此，建议使用该方法以灵敏和可重复的方式量化这十种成分。

　　注：每组n=10；数据表示为平均值±SD；Cmax，最大峰值浓度；Tmax，达到最大浓度的时间；t1/2，末端消除半衰期；AUC0–24h，0至24小时血浆浓度-时间曲线下的面积（最后一次可量化浓度）；AUC0-∞，血浆浓度-时间曲线到无穷大。经验证的LC-MS/MS方法用于研究连续14天口服给药后大鼠体内MLST的药代动力学。平均血浆浓度与时间的关系如图3所示，药代动力学参数如表1所示。根据Phoenix WinNonlin的非房室分析，所有成分达到最大浓度（Tmax）的时间在1小时内，这表明这些成分迅速达到其最大峰值浓度（Cmax）。然而，十种PK标志物的含量差异很大。芍药苷和獐牙菜苷的血浆浓度最高，但芒柄花黄素和木兰花碱的浓度低于芍药苷的4%。甘草酸和芒柄花黄素的消除半衰期（t1/2）长于12小时，表明消除缓慢。大多数成分在血液中有良好的暴露，血浆药物浓度-时间曲线ng⋅h/ml。

　　A）动物处理计划。（B）TAO症状评分的变化。（C，D）处理14天后，检测右股动脉的代表性激光散斑图像（C）和缺血与对侧后肢的血流比（D）的统计结果。（E）最后一次给药后，采集股动脉切片进行H&E（原始放大倍数20×10，比例尺50μm）免疫染色。所有数据均表示为平均值±SD（n=10）。两组在同一天的显著差异：与Sham组相比，*p0.05，**p0.01，与TAO组相比，#p0.05，##p0.01。

　　候选生物标志物的鉴定我们使用UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS非靶向代谢组学和OPLS-DA模型，在手术后24小时的血浆中和在连续给药MLST后14天的尿液中鉴定Sham和TAO大鼠之间差异表达的代谢产物。为了确认代谢谱结果的可靠性，我们选择RSD值30%的质控样品进行统计分析。经过质量控制、数据过滤和标准化，我们分别从血浆和尿液中识别出4405和11101个代谢特征。PCA用于分析代谢产物谱数据，以表征TAO大鼠的总体变化。结果表明，与Sham组相比，TAO组在血浆（图4A，B）和尿液（图5A，B）中发生了显著的代谢变化。在OPLS-DA评分图（图4C，E，C，E）中，TAO组的代谢概况可以与Sham组区分开来。此外，我们进行了200次置换检验，结果表明模型没有过度拟合（图4D、F和5D、F）。以FC＞1.5或＜0.67，VIP＞1.0，TAO和Sham之间的p＜0.05为标准，我们共选择了17种血浆和24种尿液中的差异代谢物。在血浆中，13-羟基十八碳二烯酸（13-HODE）、十八酰胺、油酸、尿酸、花生四烯酸、L-谷氨酸、假尿苷、丙酰肉碱、硬脂酸、鞘氨醇、牛磺酸、L-乙酰肉碱、胞嘧啶、二十碳五烯酸、赖氨酸（22:4（7Z、10Z、13Z、16Z）/0:0）、脱氧胆酸和尿囊素是不同的，并与TAO模型相关（表S6）。这些代谢产物水平的相对变化显示为倍数变化，即TAO大鼠与Sham大鼠的归一化强度的log2比率（图4H），而上调和下调的代谢产物分别用红色和绿色条表示。此外，在尿液中的24种潜在生物标志物中，19种代谢产物的水平在MLST给药14天后向Sham显著改变，包括胞嘧啶、脯氨酸甜菜碱、酪氨酰-脯氨酸、焦谷氨酸、肉桂酰甘氨酸、2-脱氧核糖酸、L-谷氨酰胺、硫胺素、腺苷、天冬氨酰亮氨酸、L-组氨酸、二十二碳六烯酸、黄嘌呤酸、癸二酸、苏氨酸、N-乙酰色氨酸、L-亮氨酸、尿酸、L-谷氨酸（表S7）。此外，我们在血浆和尿液样本中都发现了胞嘧啶、L-谷氨酸和尿酸。最后，代谢模式如代谢产物热图所示（图4G和5G）。

　　3第14天口服3.78g/kg MLST后的平均血浆浓度-时间曲线。所有数据均表示为平均值±SD（n=10）。

　　A，B）Sham和TAO组ESI+模式（A）和ESI-模式（B）下PCA评分的3D图。（C，E）区分ESI+模式（C）和ESI-模式（E）中Sham组和TAO组的OPLS-DA评分图。（D，F）ESI+模式（D）和ESI-模式（F）中OPLS-DA模型的置换检验。（G）从血浆样品中鉴定的TAO改变代谢物的聚类热图。对数据进行log 10变换，并通过row Z得分进行归一化。（H）TAO和Sham组基于FC值的差异代谢物（n=10）。

　　血浆样本和尿液样本的路径分析结果以气泡图的形式显示在图6中。我们选择影响值大于0.1的潜在代谢途径。在血浆样品中，这些标准导致六种紊乱的代谢途径，包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、精氨酸生物合成、鞘脂代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及花生四烯酸代谢（图6A）；在尿液样本中，我们研究了四种紊乱的代谢途径，包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、组氨酸代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（图6B）。此外，这些改变的代谢途径与先前的代谢发现部分一致。根据代谢物生物标志物与代谢途径之间的相关性分析，代谢产物生物标志物的代谢网络如图6C所示。

　　A，B）ESI+模式（A）和ESI-模式（B）下PCA评分的3D图。（C，E）ESI+模式（C）和ESI-模式（E）中OPLS-DA分析的得分图。（D，F）ESI+模式（D）和ESI-模式（F）中OPLS-DA模型的置换检验。（G）尿液样本中MLST改变的生物标志物的聚类热图（n=10）。对数据进行log 10变。