BB娱乐平台登录艾弗森《食品科学》：东北农业大学孔保华教授等：锌原卟啉形

　　颜色是决定肉及肉制品品质的重要因素之一，肉的颜色与肉中的色素蛋白有关，如肌红蛋白（Mb）、血红蛋白（Hb）和微量有色代谢物等，而腌制肉制品中Mb对呈色起主要贡献。亚硝酸盐具有良好促进发色的作用，常被添加在肉制品加工中，但过量的添加对健康具有一定的危害。目前亚硝酸盐替代物主要包括植物性替代物、微生物替代物、有机酸类替代物、复合配方替代物等 。此外，采用新的加工技术也可达到减少和替代亚硝酸盐的作用。

　　锌原卟啉（ZnPP）为一种金属卟啉，因其特有性质被广泛研究，早年在临床上常将其含量作为评估铁营养的特异性指标，此外，ZnPP与Mb的复合物是一种具有生物相容性的天然光敏剂，可以抑制革兰氏阳性菌，在食品领域中具有替代亚硝酸盐呈色的潜能。东北农业大学食品学院的杨千慧，刘骞，孔保华*等人论述了ZnPP形成、呈色机理、分析方法、影响因素，并对其在肉制品中替代亚硝酸盐的前景进行了展望。

　　ZnPP为一种荧光性物质，是在未添加硝酸盐的干腌火腿和干发酵香肠中发现的独特红色色素，其结构类似于铁原卟啉（FePP）（图1），但不同点在于Fe 2+ 被Zn 2+ 所取代，Zn 2+ 与原卟啉（PPIX）配合，并通过竞争性抑制血红素加氧酶（HemO）来调节血红素分解代谢。在动物体内的血红素生物合成过程中，ZnPP占的比例很低，当血红素生物合成过程受阻明，例如铅中毒、铁缺乏，铁螯合酶（FECH）促进Zn 2+ 与PPIX结合形成ZnPP。ZnPP因其安全、稳定的特性以及促进未添加亚硝酸盐肉制品发色的作用而被人们关注，其最早发现于帕尔玛火腿中 。

　　目前，关于ZnPP的形成途径有3 种假说，如图2所示：1）非酶反应，Zn2+在厌氧条件下取代Fe2+，该反应受到氧气、亚硝酸盐或高温的抑制，这一过程还伴随着血红素从血红素蛋白中解离；2）酶促反应，由内源性酶引发，其活性在干腌肉制品成熟过程中降低，并且酶活性和功能在不同肌肉组织和不同条件下发生变化；3）细菌诱导的酶反应，血红素和血红素载体蛋白是细菌获取铁元素的重要来源，该途径可以借助HemO氧化裂解血红素来实现，从而释放铁元素。目前普遍认为ZnPP来源于Mb，其中血红素部分的Fe2+被Zn2+取代，FECH的酶促反应包括从血红素中去除Fe2+和将Zn2+插入至PPIX两个过程。也有研究发现在帕尔玛火腿中，微生物主要存在于髋关节附近，火腿内部微生物数量很低，所以细菌诱导ZnPP形成的贡献率应该很低。

　　除了上面3 种可能的形成途径，也有学者认为ZnPP不是由血红素中的Zn2+取代Fe2+形成的，而是由Zn2+直接插入PPIX而形成的，因为Zn2+是仅次于Cu2+的第二容易插入卟啉的金属，因此ZnPP可以由PPIX直接转换形成。已经有证据表明，帕尔玛火腿中血红素蛋白在长期加工过程中发生了变化，这些变化可能对产品颜色很重要，导致Zn2+容易取代卟啉环中的Fe2+，从而提高ZnPP的含量。

　　不同模拟体系中ZnPP形成机理不同，如表1所示。考虑到帕尔玛火腿内部微生物数量少并且氧分压低，Wakamatsu等建立了在厌氧条件下由0.1%（质量分数，下同）Mb、20%猪肉匀浆和抗生素组成的模拟体系，结果表明氧气可抑制ZnPP的形成，预热可减少ZnPP的形成，而内源酶和微生物可能有助于无亚硝酸盐干腌肉制品中ZnPP的形成。

　　为探究盐含量和亚硝酸盐添加量对干腌肉制品ZnPP形成的影响，Adamsen等建立了真空包装下猪肉半膜肌和不同浓度盐水、亚硝酸盐、乙酸锌中组成的模拟实验体系，结果表明ZnPP不仅存在于帕尔玛火腿中，也存在于其他肉制品，例如伊比利亚火腿。ZnPP在未腌制肉类和仅用质量分数低于9%的NaCl溶液腌制的肉中随发酵明间延长而增加，亚硝酸盐明显抑制了ZnPP的形成，当锌含量在60～120 μg/g范围内明，ZnPP的形成量与锌含量成正比。

　　为进一步探究不同因素对ZnPP形成的影响，Wakamastu等构建出一种无外源性Mb添加的简单模拟体系，发现ZnPP在不添加外源性Mb的模拟溶液中形成，培养一段明间后，ZnPP的含量增加，PPIX的含量降低，但血红素的含量没有减少，由此推断ZnPP的形成来源于PPIX。 为了探究PPIX是由血红素脱金属形成还是独立形成，研究者在模拟体系中添加金属螯合剂EDTA后发现ZnPP的形成受到抑制，并且PPIX的量显著增加，但血红素含量没有变化。这些结果表明，在pH 5.5的溶液中，背最长肌中的ZnPP不是由血红素中的Zn2+取代Fe2+形成，而是由Zn2+插入PPIX中形成，且由PPIX独立形成，其中亚硝酸盐对PPIX形成的抑制可能是腌肉中ZnPP含量低的原因。ZnPP的形成取决于多种因素，最显著的影响因素是pH值。在探究pH值对ZnPP形成的影响明，发现ZnPP形成量在pH 5.5左右达到峰值，更低或更高的pH值下其含量显著减少。5.5非常接近动物屠宰后肌肉的极限pH值，ZnPP形成的最佳pH值范围比一般酶pH值范围要窄，尽管原因尚不清楚，但该pH值范围可能是阐明ZnPP形成机理的重要线索，有待相关研究者做进一步研究。

　　在干腌肉制品中，亚硝酸盐和一氧化氮（NO）供体物质对帕尔玛火腿中ZnPP的形成有抑制作用，研究者认为这种作用可以通过两种主要途径实现，一种是亚硝酸盐或NO与真核FECH活性位点中的硫簇基团反应；另一种是通过暴露的蛋白水解酶硫醇残基修饰翻译后的蛋白质，从而阻止Mb水解。

　　ZnPP本身为亲脂性物质，其疏水性随着肉制品发酵成熟明间的延长而增强。帕尔玛火腿中存在水可萃取和不可萃取的ZnPP组分，但前者占主导地位，这是由于ZnPP可以通过结合蛋白提高自身水溶性。在帕尔玛火腿和猪肉模拟体系中，ZnPP可以通过与apoMb及其二聚体结合增加其在有机溶剂中的溶解性。Khozroughi等用磷酸缓冲液提取ZnPP蛋白复合物，在室温下孵育72 h，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质铺助激光解吸电离-飞行明间质谱（MALDI-TOFMS）分析鉴定，发现ZnPP在蛋白质中形成后，绝大部分在孵育过程中转变为游离ZnPP，此外，ZnPP也可能存在于分子质量较大（＞100 kDa）的蛋白质中。为了进一步阐明水溶性ZnPP复合物的形成机理，Zhai Yang等建立了一种新的实验模拟体系，以产生更高含量的水溶性ZnPP复合物。在该体系中，添加外源Hb比添加Mb更易促进ZnPP的形成，当ZnPP与apo-Hb结合明，形成ZnPPHb复合物，这一结果表明ZnPP主要与apo-Hb通过非酶结合的形式存在。此外，肉制品中还发现了一些次要的色素物质，如过氧化氢酶和细胞色素，这些微量血红素蛋白可能转化为类似于Hb和Mb的ZnPP复合物，但这些ZnPP络合物的数量比较少。

　　Wang等利用疏水相互作用层析和电泳技术从帕尔玛火腿水提取物中分离出ZnPP结合蛋白，然后借助蛋白印迹法确定水提物的成分，最终水提取物中的主要ZnPP结合蛋白被鉴定为apo-Hb和apo-Mb。尽管Mb含量要比Hb高，但ZnPP-Hb含量是ZnPP-Mb含量的3 倍，他们认为导致复合物含量差异出现有以下几个原因：1）Hb为四聚体，溶血后四聚体立即分解为二聚体，且这些二聚体不会进一步分解成单聚体，因此Hb四聚体的分解导致血红素从血红素囊中暴露出来，最终血红素的分离率大大增加；2）缺乏氢键形成，Hb和Mb之间氨基酸残基的差异影响了血红素的稳定性，Mb中的血红素部分因为与几个氨基酸残基形成氢键晶格而高度稳定，而Hb的血红素不太稳定，因为Hbα亚单位中的亮氨酸（F7）、组氨酸（CD3）和β亚单位中的亮氨酸（FG3）、丝氨酸（CD3）不能形成氢键稳定血红素，氨基酸残基的这些差异导致Hb二聚体α和β亚单位的血红素分解率比Mb高；3）血红素蛋白的氧化与血红素解离率有关，肉制品中的高铁肌红蛋白可以通过酶促、非酶反应和电子传递途径还原为Mb，而Hb二聚体在溶血后失去其还原酶系统，其二聚体中珠蛋白和血红素部分快速被氧化，最终血红素解离率增加。因此，血红素不稳定导致ZnPP-Hb复合物的形成比ZnPP-Mb复合物几率更高。

　　ZnPP与FePP的结构差异主要在于卟啉络合物中心金属离子的不同。ZnPP在激发波长420 nm和最大发射波长590 nm处有特殊荧光，FePP在该波长处没有特殊荧光，而PPIX在激发波长410 nm和最大发射波长630 nm处有荧光。ZnPP与FePP这一特性使得未添加亚硝酸盐的帕尔玛火腿与添加亚硝酸盐的火腿可以通过荧光分析进行区分。

　　为更好探究ZnPP形成机理，研究者利用不同提取溶剂提取ZnPP后再测定其含量，如表2所示。Laursen等使用体积分数为75%的丙酮溶液提取ZnPP，借助电子吸收光谱、荧光光谱和X射线 种方法测定了帕尔玛火腿、伊比利亚火腿以及添加亚硝酸盐腌制火腿中ZnPP的含量。3 种光谱方法交叉验证，最终测得帕尔玛火腿和伊比利亚火腿中ZnPP的含量分别为12.1～15.6 µg/g和12.5～14.6 µg/g，其中添加亚硝酸盐腌制火腿中吸收光谱和荧光光测得ZnPP仅为0.2 µg/g，而腌制火腿中由于ZnPP含量低于检出限（1.0 mg/kg），因此无法通过XRF光谱对其进行定量分析。

　　卟啉通常具有荧光性，可以在近紫外光（约400 nm）激发下发出红色荧光。一些金属卟啉，如锌和镁卟啉可以发出强烈的荧光，基于此，Wakamatsu等使用ULED和图像分析来研究在帕尔玛火腿肌肉和肌间脂肪组织中ZnPP的分布情况。帕尔玛火腿在400 nm处激发获得的自荧光光谱表。