BB娱乐平台登录艾弗森基于HippoYAP信号通路探究粉防己碱抗乳腺癌耐

　　乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升。据统计，2020年女性乳腺癌已经超越肺癌成为全球癌症发病率最高的癌种。2020年全球新增乳腺癌患者达到226万例，死亡68万例，分别占全球新发癌症病例和死亡病例的11.7%和6.8%，乳腺癌成为女性因癌症死亡的主要原因[1-2]。我国乳腺癌发病率在近30年中每年增长2%～3%，成为威胁女性健康的“头号癌症杀手”，卫生部已将乳腺癌列为我国肿瘤防治的重点之一[3-4]。

　　防己 Stephaniae Tetrandrae Radix 又称粉防己、汉防己，是一种常用的中药，其主要成分为粉防己碱，在中医中广泛用于治疗哮喘、痢疾发烧等疾病。主要具有抗炎、抗肿瘤、抗糖尿病、抗高血压、抗菌、镇痛、抗氧化、抗疟疾虫、抗血小板等药理作用，近年来粉防己碱的抗肿瘤作用受到众多研究者的关注。临床发现乳腺癌细胞具有极强的增殖分化、侵袭和转移的能力，阿霉素是临床上治疗乳腺癌的常用药物，但阿霉素治疗乳腺癌过程中易产生耐药性，难以达到良好的临床治疗效果。因此目前急需寻找能够抑制乳腺癌细胞对阿霉素耐药性的方法和途径，进一步提高阿霉素的临床疗效 [5-7] 。导致乳腺癌多重耐药的机制为药物外排蛋白在三磷酸腺苷（ adenosine triphosphate ， ATP ）供能的条件下将进入细胞的药物排出胞外，减少药物在癌细胞内的富集，降低药效，引起癌细胞中的多重耐药性。乳腺癌多重耐药产生的主要耐药蛋白为 P- 糖蛋白（ P-glycoprotein ， P-gp ）、多药耐药相关蛋白（ multidrug resistance associated protein ， MRP ）、乳腺癌耐药蛋白（ breast cancer resistance protein ， BCRP ），是评价和衡量乳腺癌细胞多重耐药特性强弱的指数 [8-11] 。中药具有整体观念、高效低毒、多靶点作用调控的特点，相关研究表明多种中药活性成分都能够通过调控药物外排蛋白表达、促进肿瘤细胞凋亡逆转乳腺癌多重耐药，表现出对乳腺癌多重耐药的抑制作用 [12-13] 。而且相关研究还发现粉防己碱能够通过调控 Yes- 相关蛋白同源癌蛋白 1 （ homologous oncoproteins Yes-assoc iated protein 1 ， YAP1 ）表达从而介导 Hippo 信号通路诱导肿瘤细胞发生凋亡，推测粉防己碱可以通过介导乳腺癌多重耐药外排蛋白，增加乳腺癌细胞内粉防己碱和阿霉素的蓄积，进而降低 YAP 表达，激活 Hippo 信号途径诱导乳腺癌细胞发生凋亡，从而发挥抗肿瘤作用，实现临床应用价值 [14-18] 。

　　将 MCF-7/ADR 细胞从 − 80 ℃冰箱取出，水浴加热融化，加入 2 mL 含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基， 1500 r/min 离心 5 min ，弃去上清，重悬细胞，平均分到 2 个培养瓶中，加入 5 mL 细胞培养液，在 5% CO2 、 37 ℃恒温培养箱中培养。细胞长势良好时进行传代，弃去培养液，用 PBS 清洗 3 次，再加入胰蛋白酶溶液消化，反复吹打得细胞悬液，分装到 2 个细胞培养瓶中，加入 5 mL 细胞培养液，于细胞培养箱中培养。

　　MCF-7/ADR 细胞以 3 × 104/mL 接种于 6 孔板，于培养箱中培养 24 h 。设置对照组和粉防己碱（ 7 、 14 、 28 μmol/L ）组，各给药组加入 1 mL 粉防己碱，对照组加入 1 mL 培养基。培养 48 h 后，用倒置显微镜观察并拍照；每孔中加入 1 mL 多聚甲醛固定 1 h ，弃去上清液，冲洗后加入 200 μL Hoechst 33258 染色液，水浴加热 30 min 后，用荧光显微镜观察并拍照。

　　按“ 2.3 ”项下方法进行分组和给药，培养 48 h 后，吸取上清液，加入胰蛋白酶消化后离心，弃去上清液，加入 70% 冰乙醇，固定 24 h 后离心。加入 Annexin V 和 PI 染液 800 μL ，用尼龙网将染色后的细胞过滤。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

　　取对数生长期、生长状态良好的 MCF-7/ADR 细胞， PBS 洗涤后加入胰蛋白酶消化，离心后弃去上清液，重悬细胞，用台盼兰染色后以 1 × 103/ 孔接种于 96 孔板，培养 12 ～ 18 h 。 PBS 清洗后，按“ 2.3 ”项下方法进行分组和给药，连续培养 7 d 后弃去培养基， PBS 洗涤后用甲醇固定 10 min 。洗涤后用吉姆萨染液染色，洗涤干燥后置于倒置显微镜下观察细胞集落形成率并拍照。

　　MCF-7/ADR 细胞以1 ×105/mL 接种于6 孔板，每孔1 mL ，培养24 h 。按“2.3 ”项下方法进行分组和给药，培养48 h 后，弃去培养液，用PBS 洗涤1 次，每孔加入0.1 mL 10% 甲醇溶液，固定细胞30 s 。吸去甲醇溶液，每孔加入0.1 mL 结晶紫染液，室温孵育20 min 。弃去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37 ℃烘干后在显微镜下观察并拍照。

　　按“ 2.3 ”项下方法进行分组和给药，培养48 h 后，收集细胞，加入含PMSF 的细胞裂解液，裂解30 min 后离心15 min ，取上清液，煮沸使蛋白变性，采用BCA 试剂盒定量蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，封闭2 h 后加入一抗，4 ℃孵育过夜；洗膜后加入二抗，室温孵化2 h ，洗膜后加入化学发光试剂，显影并用显色仪拍照。

　　用 SPSS 21.0 软件进行统计分析，数据以 表示，多样本均数比较采用One-way ANOVA 分析。

　　采用倒置显微镜、荧光显微镜观察粉防己碱对 MCF-7/ADR 细胞形态的影响，如图 2 所示，与对照 组比较，粉防己碱使肿瘤细胞形态有一定改变，随着给药浓度的增加，细胞大部分变圆漂浮于培养基中，并且出现凋亡小体，且细胞膜破碎明显，细胞排列稀疏，细胞核的荧光强度最强。

　　如图 3 所示，与对照组比较，各剂量粉防己碱组 MCF-7/ADR 细胞凋亡率均显著升高（ P ＜ 0.01 ），呈剂量相关性。

　　单个 MCF-7/ADR 细胞在体外持续增殖 6 代以上，其后代形成 1 个细胞集落，且每个克隆均包含 50 个细胞以上，大小为 0.3 ～ 1.0 mm 。如图 4 所示， 对照组肿瘤细胞的集落数量较多，粉防己碱给药组集落数量较少，且呈剂量相关性。表明粉防己碱可以抑制 MCF-7/ADR 细胞的克隆形成能力。

　　如图 5 所示，与对照组比较，粉防己碱给药组紫色区域呈剂量相关性地减少，且颜色明显变浅。表明粉防己碱能够显著抑制 MCF-7/ADR 细胞的侵袭能力。

　　3.6.2 粉防己碱对 MCF-7/ADR 细胞 Hippo 通路关键调控蛋白表达的影响 如图 7 所示，与对照组比较，粉防己碱各剂量组 MCF-7/ADR 细胞中 MST1 和 LATS1 蛋白表达水平均显著升高（ P ＜ 0.01 ）， YAP1 和 TAZ 蛋白表达水平均显著降低（ P ＜ 0.01 ），且呈剂量相关性。

　　3.6.3 粉防己碱对 MCF-7/ADR 细胞凋亡相关蛋白表达的影响 如图 8 所示，与对照组比较，粉防己碱各剂量组 MCF-7/ADR 细胞中 Caspase-3 、 Cyt-C 和 Bax 蛋白表达水平均显著升高（ P ＜ 0.01 ）， Bcl-2 蛋白表达水平均显著降低（ P ＜ 0.01 ），且呈剂量相关性。

　　乳腺癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤，其增殖、分化、侵袭、转移等特性使其在临床上难以得到有效治疗。阿霉素是目前临床上广泛使用的一种抗肿瘤药物，但由于其在抗肿瘤作用下容易发生耐药性，导致疗效不佳。如何克服乳腺癌的耐药性是目前亟待解决的问题。根据有关文献报道，乳腺癌产生多重耐药的机制为在ATP供能的情况下，药物外排蛋白会将进入细胞的药物排出胞外，减少了药物在肿瘤细胞中的富集，进而降低了药效，产生了肿瘤细胞的耐药。