BB娱乐平台登录艾弗森成都中医药大学： 茱萸丸抑制氧化三甲胺介导的ROS

　　动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是动脉内膜的脂质、血液成分沉积，平滑肌细胞及胶原纤维增生，伴有坏死及钙化等不同程度病变的慢性进行性病理过程[1]。流行病学研究显示，在我国有超过3.3亿的心血管病患者，且导致的死亡人数占全球死亡人数的1/3，而AS就是导致心血管疾病的最主要原因[2]。目前治疗AS的药物主要针对脂质代谢和血小板活化途径，如他汀类和阿司匹林等[3]，治疗效果有限，并能引发细胞损伤、肝肾损伤及肌病等不良反应[4]。肠道菌群与AS之间有密切联系，调节肠道菌群稳态已成为防治AS新靶点。研究表明，氧化三甲胺（trimethylamine oxide，TMAO）作为肠道菌群衍生的代谢产物，是炎症调控的关键因子，可增加炎症因子释放或激活相关炎症通路，促进泡沫细胞在血管内沉积[5]。TMAO升高会导致大量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的生成，过量的ROS诱导硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）从硫氧还蛋白（thioredoxin，TRX）中解离。TXNIP降低TRX的ROS清除能力并与核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白（NOD like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）结合，介导NLRP3炎症小体与凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3前体（pro-cystein-asparate protease-3，pro-Caspase-3）的组装。随后Caspase-1的自切割和激活反过来导致白细胞介素-1β前体（pro-interleukin-1β，pro-IL-1β）和pro-IL-18加工成其成熟形式，然后诱导其他促炎基因的表达，引发氧化应激和炎症反应，促进AS形成[6]。

　　中医学认为，中焦气机升降失司，脾不散津，津液代谢紊乱，聚湿生痰，日久生瘀，痰瘀互结阻于脉道，导致AS 发生 [7] 。因此，升清降浊、恢复中焦升降功能，是调控血脂、防治AS 的关键。茱萸丸出自《太平圣惠方》，方中黄连、吴茱萸等比配伍，黄连味苦而性寒，吴茱萸味辛苦而性热，二者苦辛相合，具有苦辛化浊的功效 [8] 。课题组前期研究证实，黄连、吴茱萸配伍可显著调控高脂模型动物血脂，且1∶1 调血脂效果最佳 [9] ，同时可通过巨噬细胞极化、影响脂代谢相关基因发挥抗炎效应 [10-11] 。为进一步探讨茱萸丸防治AS 的作用机制，本研究以TMAO 介导的ROS/TXNIP/NLRP3 信号通路为切入点，探讨其减轻内皮细胞损伤的机制，为临床治疗AS 提供新思路。

　　SPF 级雄性 C57BL/6J 小鼠 13 只，同品系的低密度脂蛋白受体敲除（ low density lipoprotein receptor knockout ， LDLR −/− ）小鼠 53 只，体质量 （22 ±2 ）g ，6 周龄，购自成都达硕实验动物有限公司，动物合格证号SCXK （川）2020-034 。动物饲养于成都中医药大学动物中心清洁级动物房，使用许可证编号SYXK （川）2019-049 ，温度22 ～25 ℃，相对湿度50% ～70% ，12 h 明暗循环，自由饮水进食。喂养小鼠的基础饲料及高脂饲料均购自江苏协同医药生物工程有限责任公司，合格证号SCXK （苏）2020-0018 。高脂饲料由78.85% 基础饲料、21% 脂肪、0.15% 胆固醇构成，所有饲料均经 60Coγ 射线辐照灭菌处理。动物实验通过成都中医药大学动物实验伦理委员会审查（伦理编号2021DL-001 ）。

　　茱萸丸由黄连5 g 、吴茱萸5 g 组成。黄连（批号190901 ）、吴茱萸（批号191001 ）由成都中医药大学附属医院制剂室提供，经成都中医药大学鉴定教研室严铸云教授分别鉴定为毛茛科植物黄连 Coptis chinensis Franch. 的干燥根茎、芸香科植物吴茱萸 Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth. 的干燥成熟果实，符合《中国药典》2020 年版要求。

　　称取50 g 黄连、50 g 吴茱萸后，加入10 倍量水浸泡1 h ，然后煎煮40 min 滤过，滤渣加入9 倍量水继续煎煮30 min ，合并2 次滤液后放入真空冻干机中制作。最终100 g 茱萸丸获得17.21 g ，即每克中含5.81 g 药材，保存于4 ℃备用。采用高效液相色谱仪对茱萸丸中小檗碱、黄连碱、吴茱萸碱和吴茱萸次碱4 种主要生物碱进行检测 [12] ，结果显示，茱萸丸中含有36.8 mg/g 小檗碱、14.9 mg/g 黄连碱、0.78 mg/g 吴茱萸碱和0.33 mg/g 吴茱萸次碱。

　　经过适应性喂养后，13 只C57BL/6J 小鼠作为对照组，继续以基础饲料喂养。53 只同品系的LDLR −/− 小鼠给予高脂饲料喂养造模，每天2 次投喂（8: 00 、16: 00 时各1 次），自由饮水及活动12 周，构建AS 模型 [13] 。造模周期12 周，然后在对照组及造模组中各随机选取3 只小鼠进行主动脉根部油红染色判断造型是否成功，主动脉斑块形成可判定为AS 造模成功 [14] 。造模成功后，将50 只LDLR −/− 小鼠按体质量随机分为模型组及茱萸丸低、中、高剂量（130.54 、261.08 、522.16 mg/kg ，分别相当于临床剂量的0.5 、1 、2 倍 [15] ）组和阿托伐他汀（10.40 mg/kg ）组，每组10 只。各给药组ig 相应药物，对照组和模型组ig 等体积无菌蒸馏水，1 次/d ，连续给药12 周。

　　末次给药后12 h 禁食不禁水，摘眼球取血。室温静置2 h ，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min ，收集上层血清。按照试剂盒说明书操作，采用全自动生化分析仪检测各组小鼠血清中TC 、TG 、LDL-C 、HDL-C 水平。

　　将采集完血清标本的小鼠脱脊椎处死，剪开胸骨，暴露心脏，1 mL 注射器穿刺左心室注入；磷酸盐缓冲液冲洗主动脉后完整分离，在冰上剪段，用4% 多聚甲醛固定、最佳切削温度（optimum cutting temperature ，OCT ）包埋剂处理，制成厚度为5 μm 的石蜡切片，进行常规HE 、Masson 染色，光学显微镜下观察主动脉病理变化并拍照保存。

　　将冰冻切片晾干，置于异丙醇浸泡5 min ，油红O 染液孵育10 min ，分化后用苏木素复染2 min ，冲洗，少许封片，显微镜下观察和摄片，采用Image pro plus 6.0 软件分析。

　　末次给药后，收集小鼠新鲜粪便。戴一次性无菌手套，左手抓住小鼠，右手轻轻柔按揉小鼠腹部，刺激排便。当有粪便排出时，用一次性镊子夹取粪便2 ～3 粒，置于灭菌冻存管，液氮保存。每取1 只小鼠粪便换1 次镊子，以防交叉感染，影响肠道菌群结果，且夹取粪便放入冻存管中务必迅速，以防空气中暴露太久，导致感染。小鼠粪便样本送至武汉迈维生物科技有限公司进行16S rRNA 测序，按试剂盒说明进行操作。

　　2.8.3PCR 产物电泳检测和纯化 1% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的条带大小，使用磁珠法进行自动化纯化。

　　取各组主动脉组织，按照ROS 试剂盒说明书操作，激发和发射波长分别为490 、525 nm ，测定ROS 吸光度（ A ）值，根据样品和对照相对荧光单位（relative fluorescence unit ，RFU ）的差值计算ROS 含量。

　　石蜡组织切片经脱蜡、水化、抗原修复、标记及封闭，滴加TXNIP 抗体（1 ∶50 ），4 ℃孵育过夜；磷酸缓冲液浸洗3 次，滴加荧光二抗（1 ∶100 ，滴加CY3-TSA ），湿盒中37 ℃孵育1 h ，PBST 浸洗3 次，血清室温封闭30 min ，吸掉封闭液，滴加稀释的NLRP3 抗体（1 ∶50 ），4 ℃孵育避光过夜，PBST 浸洗3 次，滴加荧光二抗（1 ∶100 ，FITC-TSA ），湿盒中37 ℃孵育1 h ，PBST 浸洗3 次，滴加DAPI 避光孵育5 min 复染细胞核，PBST 浸洗4 次去处多余的DAPI ，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，荧光显微镜下观察并拍照记录，采用Image pro plus 6.0 软件进行分析。

　　每组取3 只小鼠主动脉组织进行蛋白提取，使用BCA 测定各组总蛋白浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，分别加入TXNIP （1 ∶1 000 ）、NLRP3 （1 ∶1 000 ）、GAPDH （1 ∶5 000 ）一抗，4 ℃摇床孵育过夜；加入二抗（1 ∶10 000 ），4 ℃摇床孵育2 h ，显影曝光，使用ImageJ 1.44 软件对条带进行分析。

　　采用总RNA 提取试剂盒提取主动脉组织中总RNA ，采用超微量紫外分光光度计测定RNA 浓度。采用iScript™ cDNA 合成试剂盒将RNA 逆转录为模板cDNA 。采用Sso Advanced TM Universal SYBR ®Green Supermix 试剂盒进行qPCR 反应。反应条件设置为95 ℃预变性30 s ，95 ℃变性5 s ，60 ℃退火30 s ，40 个循环，收集荧光信号，结果采用2 −ΔΔCt 计算mRNA 的相对表达量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，引物序列见表1 。

　　采用SPSS 24.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以 表示，先进行正态分析和方差齐性检验，若二者均符合，组间比较采用单因素方差（One-way ANOVA ）分析；若不符合正态分布或方差齐性检验，采用非参数秩和检验，相关性采用Pearson 相关性分析。

　　如表2 所示，与对照组比较，模型组小鼠血清TG 、TC 、LDL-C 水平显著升高（ P ＜0.01 ），HDL-C 水平显著降低（ P ＜0.01 ）；与模型组比较，各给药组小鼠血清TG 、TC 、LDL-C 水平显著降低（ P ＜0.05 、0.01 ），HDL-C 水平显著升高（ P ＜0.01 ）。

　　如图1 所示，对照组小鼠主动脉可见血管壁各个层次排列整齐，结构清晰，少见皱褶及空泡，几乎无红染及胶原着色。与对照组比较，模型组主动 脉内膜大面积增厚，脂质斑块增多沉积，结构模糊化并形成明显的泡沫细胞，大量褶皱及空泡，红染形成，部分区域形成特征性 AS 斑块，斑块有较大范围的胶原蛋白沉积。与模型组比较，各给药组主动脉斑块及血管壁泡沫细胞均呈现不同程度的改善，胶原纤维增加减少，随着茱萸丸剂量的增。