BB娱乐平台登录艾弗森发中文核心案例：基于网络药理学与动物实验探究桂花醇

　　慢性脑缺血是大脑灌注不足所引起的脑功能障碍疾病 [1] 。近年来，慢性脑缺血的患病率逐年攀升，其引发进展性的认知、学习、记忆能力下降使患者及家属的生命质量都受到巨大冲击 [2] 。然而，目前临床治疗慢性脑缺血尚缺乏理想药物。慢性脑缺血起病慢、防治时间长，及早识别和干预可以有效地阻止疾病的发展，提高患者生活质量。研究表明，慢性脑缺血的病理机制十分复杂，包括神经细胞凋亡、氧化应激、炎性损伤等 [3] 。长期脑组织血流量低灌注引发神经元死亡，细胞凋亡便是其中主要的死亡形式，而脑白质和海马 CA1 区的神经元凋亡又将引起认知、学习记忆功能障碍 [4] 。因此抑制或减少脑缺血后的神经元凋亡，对恢复缺血后神经功能至关重要。

　　桂花属药食同源类中药 [5] ，目前对其资源开发主要集中在浸膏、精油和食材应用方面，而对于其药用价值还缺乏深入探讨 [6] 。传统医学研究发现，桂花性温，味辛、无毒，富含多种芳香成分，具芳香开窍药的特性 [7] 。芳香开窍药易通过血脑屏障、改善脑微循环、减轻脑水肿等途径抵抗脑缺血损伤，已成为治疗中枢神经系统疾病的常用药物 [5,8] 。已有研究报道桂花醇提物可有效改善半乳糖引起的小鼠记忆力减退现象，并抑制小鼠大脑中神经胶质纤维酸性蛋白（ glial fibrillary acidic protein ， GFAP ）、神经营养因子 -3 （ neurotrophin-3 ， NT-3 ）的产生，从而发挥神经损伤的保护作用 [9] 。 Lee 等 [10] 研究表明桂花醇提物可通过抗氧化作用保护大鼠皮层神经元免受 6- 羟多巴胺（ 6-hydroxydopamine ， 6-OHDA ）和谷氨酸诱导的神经元损伤。此外，桂花醇提物中的苯乙 醇苷也能有效抵抗氯化钴诱导的 PC12 神经细胞缺氧损伤 [11] 。目前关于桂花抗缺血损伤的机制尚未阐明，其药用价值的开发与应用受限。基于以上研究推测桂花醇提物或能成为改善慢性脑缺血神经损伤的潜力药物。 网络药理学是一门从多层次、多角度分析药物与疾病关系，预测活性药物靶点、作用机制等问题的新兴学科 [12] 。本研究拟借助网络药理学方法探究桂花治疗慢性脑缺血的活性成分及作用靶点，并结合动物实验评价桂花醇提物对慢性脑缺血小鼠神经损伤的主要保护机制，为后期桂花相关产品的研发提供理论依据。

　　SPF 级雄性 KM 小鼠 60 只，体质量 18 ～ 25 g ，购自成都达硕实验动物有限公司，许可证号 SCXK （川） 2020-030 ，饲养于成都医学院动物实验中心，适应性饲养 7 d 后进行实验。动物实验遵守成都医学院动物伦理委员会的伦理要求（批准号：成医动伦 [2022] 第 015 号）。

　　2.1.1 获取桂花活性成分及潜在靶点 通过 TCMSP2.3 数据库，选择以“ Herb name ”和“桂花”为检索词，将桂花活性成分筛选条件设为口服生物利用度（ oral bioavailability ， OB ）≥ 30% 、类药性（ drug-likeness ， DL ）≥ 0.18 ，并将候选生物活性化合物 2D 结构的 SDF 文档导入 SwissTargetPrediction 数据库，以确定桂花活性成分的靶点。再利用 BATMAN 数据库，选择“ Herb or Herb list ”以“ GUI HUA ”为关键词，筛选条件设置为 Score cutoff ≥ 20 、 P ＜ 0.05 ，筛得桂花的活性成分及作用靶点。通过文献检索补充已报道且有药理作用的桂花活性成分，进入化源网搜索得到其英文名，再进入 PubChem 输入其英文名得到相关 SMILES 号。打开 SwissTargetPrediction 数据库，将 PubChem 得到的 SMILES 号输入，点击预测即可得到化合物相关靶点。将上述数据库结果汇总、去重，建立桂花活性成分 - 靶点数据集。

　　2.1.2 获取慢性脑缺血疾病靶点 以“ chronic cerebral ischemia ”为关键词，检索疾病数据库（ OMIM 、 GeneCards ）中的疾病靶点，将 2 个数据库结果合并、去重，所得结果即为慢性脑缺血疾病靶点数据集。

　　2.1.3 获取桂花与慢性脑缺血交集靶点并构建蛋白质 - 蛋白质相互作用（ protein-protein interaction ， PPI ） 网络 将桂花和慢性脑缺血的潜在靶点导入 VENNY2.1 以获取交集靶点。将得到的交集靶点导入 STRING 数据库，选择交互作用阈值＞ 0.4 ，构建 PPI 网络图。获得 TSV 格式文件，并将其导入 Cytoscape 软件进行网络拓朴分析。

　　2.1.4 桂花与慢性脑缺血交集靶点的基因本体（ gene ontology ， GO ）功能及京都基因与基因组百科全书（ Kyoto encyclopedia of genes and genomes ， KEGG ）通路富集分析 在线打开 DAVID 数据库，将核心靶点导入到数据库中，选择官方基因名称，物种限定为“ Homo sapiens ”，分析背景选择为“ Homo sapiens ”，分别进行 GO 富集分析和 KEGG 通路分析并整理所得数据。获得显著富集且与慢性脑缺血相关的通路及生物学过程， P ＜ 0.05 表示具有统计学意义，按基因数进行排序，筛选出具有显著差异的生物过程和可靠的靶点通路，在线打开微生信绘图网站绘制柱状图和气泡图，并将所得的通路构建“成分 - 靶点 - 通路”网络。

　　2.2.1 桂花醇提物的制备 桂花醇提物由成都医学院国家中医药管理局中药药剂学二级实验室制备提供。称取 200 g 桂花，加入 95% 乙醇 2400 mL ，回流提取 3 h ， 200 目滤布滤过，提取液 50 ℃减压浓缩至相对密度为 1.05 （ 50 ℃）的清膏，冷冻干燥得桂花乙醇提取物 64.1 g （即 1 g 提取物相当于 3.12 g 桂花生药），采用高效液相色谱法测得其中毛蕊花糖苷、红景天苷质量分数分别为 30.03% 、 5.21% 。

　　2.2.2 慢性脑缺血模型复制、分组及给药 采用右侧颈总动脉结扎法制作慢性脑缺血小鼠模型 [13] ，模型复制成功评判标准 [14] ： ① 结扎后小鼠右眼变为浅白色，自然苏醒后，右眼半闭且颜色转变成微红； ② 激光散斑血流检测小鼠右侧脑血流较左侧下降 20% ～ 30% ，将造模符合标准的小鼠纳入研究。小鼠随机分为假手术组、模型组、脑络通（ 195 mg/kg ）组和桂花醇提物低、高剂量（ 125 、 375 mg/kg ）组，每组 10 只。脑络通胶囊给药剂量为 1.5 ～ 3 g/d ，取 1.5 g/d ；桂花取人用生药量 3 、 9 g[15] ， 体质量以 70 kg 计，依据人与小鼠体表面积换算系数得到小鼠桂花低、高剂量组生药量分别 390 、 1170 mg/kg 。并根据提取物得率（即 1 g 桂花相当于 0.32 g 提取物）换算得到小鼠的给药剂量分别为 125 、 375 mg/kg 。各给药组连续 30 d ig 相应药物（ 10 mL/kg ），假手术组和模型组 ig 等体积的生理盐水。

　　2.2.3 神经行为评价 给药结束后，采用大小鼠旷场活动实验系统评估各组小鼠自发行为及探索行为。旷场箱底部由 40 cm × 40 cm 的光滑黑板构成，侧壁由高 40 cm 的光滑黑板构成，配有动物行为学 数据自动采集和处理系统。数码摄像头置于旷场箱正上方 1 m 处，用于记录小鼠整个旷场箱视野内的运动 影像。旷场实验参考文献方法 [16] ，将底部 20 cm × 20 cm 的正方形区域划分为中央区，小鼠放入中央区的格子，打开摄像头开始计时。每只小鼠实验时间 5 min ，第 1 分钟为适应时间，不进行计数，第 2 分钟开始计录小鼠在 4 min 内的站立次数及中央区域运动距离，连续测试 3 d 。

　　2.2.4 苏木素 - 伊红（ HE ）染色 观察脑组织病理变化 旷场实验结束后，小鼠 ip 10% 水合氯醛后断头后取脑，置 4% 多聚甲醛浸泡 1 周固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、 HE 染色，光学显微镜下观察脑组织海马区细胞结构变化并拍摄图片。

　　2.2.5 TUNEL 染色 观察脑组织神经细胞凋亡情况 脑组织经固定、包埋、切片后，按照 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，在 200 倍光镜下，观察大脑皮层神经细胞凋亡情况，统计正常及凋亡神经细胞数量，计算细胞凋亡率。

　　2.2.6 小鼠海马组织 ChAC 和 ChE 含量检测 小鼠处死后，迅速取脑，冰上剥离海马组织，加入预冷的生理盐水，冰浴条件下匀浆处理， 3000 r/min 离心 10 min ，取上清按照试剂盒说明书进行检测。

　　2.2.7 Western blotting 检测海马组织 PI3K/Akt 信号通路及凋亡相关蛋白表达 取各组小鼠海马组织，加入 RIPA 裂解液（ RIPA ∶ PMSF ∶ 磷酸酶 100 ∶ 1 ∶ 1 ），提取总蛋白， BCA 法测定蛋白含量。蛋白样品经 12% 十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至 PVDF 膜， 5% 脱脂奶粉封闭 1.5 h ，加入一抗， 4 ℃ 过夜孵育； TBST 洗膜后，加入二抗（ 1 ∶ 5000 ）， 37 ℃ 孵育 1.5 h ； TBST 洗膜后，结合 ECL 化学发光法显影，凝胶成像系统采集图像， Image J 软件进行分度值分析。

　　所有数据用 SPSS 25.0 软件进行分析。各组计量资料符合正态分布及方差齐性者以单因素方差分析，偏态分布的计量资料先用 Kruskal-Wallis 法进行组间总体比较，并以 表示。

　　3.1.2 桂花的 GO 功能与 KEGG 通路富集分析 在线打开 DAVID 数据库，导入 20 个“桂花 - 慢性脑缺 血”共同靶点，分别从生物过程（ biological process ， BP ）、分子功能（ molecular function ， MF ）、细胞组成（ cellular component ， CC ） 3 个方面进 行功能富集分析，根据基因数进行排序，对富集结果排名靠前且 P ＜ 0.05 的条目进行分析。结果显示，桂花治疗慢性脑缺血靶点的生物过程与细胞凋亡过程的负调节、 RNA 聚合酶 II 启动子转录的正向调节、信号转导、蛋白质磷酸化的正向调节等相关，细胞组分主要富集于细胞质、质膜、胞质、核、核质、膜筏等，分子功能则与蛋白质结合、酶结合、蛋白激酶活性等密切相关（图 2-A ）。 KEGG 结果显示共有 131 条信号通路被显著富。